一种适用于遗传性非息肉病性

结直肠癌家系遴选中的方法

金黑鹰1崔龙1孟荣贵1刘飞2 、阎于梯3 、丁义江2 、姚航1傅传刚1喻德洪1

1第二军医大学附属长海医院肛肠外科(200433)

2南京市中医院肛肠外科(210001)

3甘肃省人民医院肛肠外科(730000)

关键词:遗传性非息肉病性;结直肠癌;免疫组化;微卫星不稳定;筛选

结直肠癌 是一种常见的恶性肿瘤，占所有恶性肿瘤发病的第4位，近年来有逐渐上升的趋势。对于结直肠癌治疗和预防的研究是目前肿瘤研究的重要课题之一。近年来研究表明，约有20%的结直肠癌具有遗传性或遗传易感性，最常见的遗传性结直肠癌是遗传性非息肉病性结直肠癌(Hereditary nonpolyposis colorectal cancer,HNPCC)，是一种常染色体显性遗传性疾病，约占结直肠癌5%一15%，其发病的分子遗传学的原因是由于错配修复(MMR)基因的种系突变，MMR基因的突变导致DNA复制过程中错配增加，基因组的微卫星不稳定(MSI) 而使肿瘤发生[Ill。尽管HNPCC在临床表现与散发性结直肠

癌没有差异，但是该疾病与散发性结直肠癌相比，有如下特征:① 发病早，平均发病年龄为47岁。② 近端结肠多见。③ 多原发癌常见。④ 肠外肿瘤多见。⑤ 勃液腺癌多见。⑥ 预后较好。而且对于HNPCC家族成员进行随访和干预，可以降低结直肠癌的发生率和死亡率Iz,al o H NPCC的诊断标准是Amsterdam标准，规定一个家系中至少在2代人中至少有3例结直肠癌的患者、至少1例在50岁前发病、排除家族性腺瘤性息肉病。MMR基因突变检测是确定HNPCC的最根本的

方法，但是基因检测费时、昂贵，难以在临床进行基金项目:国家自然科学荃金资助项目(39970823, 30170927)

二、一种适用于遗传性非息肉病性结直肠癌家系遴选中的方法广泛应用。我们用免疫组化方法研究了MMR基因家族中hMLHl和hMSH2蛋白表达，并应用PCR一SSCP方法检测肿瘤组织的MS1特征，对其在HNPC(家系遴选中的特异性和敏感性进行探讨，以期发现能在临床中广泛应用的方法。

1 资料与方法

1.1 临床资料

HNPCC 组:符合Amsterdam 标准的HNPCC患者共6家，系12例患者，男女各6例，发病年龄32-75岁(中位数45岁)，其中升结肠癌4例，横结肠癌1例，降结肠癌1例，乙状结肠癌2例，直肠癌4例。散发性结直肠癌组:病理诊断的结直肠癌16例，家族中无结直肠癌及其他器官恶性肿瘤患者，男10例，年龄40^-71岁(中位数50岁)，升结肠癌3例，乙状结肠癌3例，直肠癌10例。

1.2 hMLH1和hMSH2的免疫组化(IHC)检测选取 含 有 肿瘤和正常组织的石蜡切片，采用

S一P试剂盒(Dak。公司)进行免疫组化技术进行检测。4 km石蜡切片脱蜡，PBS洗3 X 3 min,3%H,O,，室温20 min，切片浸人0. 01 mol/L,pH6。柠檬酸盐缓冲液中，980C 20 min，自然冷却;兔抗人hMLH1和hMSH2抗体(Santa Cruz公司，产品编号:sc一581,sc一494)稀释1:100,4℃过夜;生物素化马抗兔二抗1，100, 37-C30m in,PB S洗3X3m in;链霉素卵白素辣根过氧化物酶1:80,3 70C30m in;0. 05% 3'3二氨基联苯胺(DAB)+ 0.030aH z0: 显色8-v12m in,水洗，吹干，树脂封片。结果判定:肿瘤组织和正常私膜均呈棕黄色，为hMI_H 1和hMSH2蛋白正常表达，表示为阳性;若肿瘤组织阴性表达而正常茹膜阳性表达，表示有杂合性缺失，提示hMLHI和hMSH2基因有突变，表示为阴性;若正常勃膜也为阴性，可能过程有错误，应重做。所有检测均设立阳性和阴性对照。

1.3 微卫星不稳定(MSI)检测

1.3.1 基因组DNA抽提:① 肿瘤组织DNA抽提:取石蜡包埋组织，切取5 pm的切片3-4片，二甲苯脱蜡，采用上海生工的】)NA抽提试剂盒(编码:SK201)，按说明书进行抽提。②外周血DNA抽提:取相应患者的外周血5 ml，采用酚氯仿抽提法。抽提产物以分光光度计测定其浓度川。

1.3. 2 PCR法扩增微卫星序列:根据文献报道设计BAT2 5,BAT2 5,D 2S123,D 5S346和D17S250引物157;P CR反应体系为50p m:模板DNA1 00n g,上下游引物各5 pl(终浓度1 pmol/L),10 pmol/LdNTP1 p l,promegaT aq酶1p l,M g2+2 .5 m mol/I，加水至50p l;95 0C 5m in，然后950C 40s ,550C1m in,720C 40s 共35循环;72℃延伸3m in,40 C保存。PCR产物已1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.3.3 银染单链多态性分析(SSCP):将患者肿瘤组织和外周血PCR产物加热8 min，加样于10%非变性聚丙烯凝胶，70 V电泳12 h。以promega银染试剂盒(编号:Q4132)进行染色。

1.3.4 结果判定:若肿瘤组织和正常组织微卫星序列相比，在凝胶上出现不同的条带，即判断为阳性;如果两者相同，判断为阴性。若5个微卫星标志中2个以上阳性则为MSI一H,1个阳性为MSI一L、均阴性为Mss }

2 结果

2.1 免疫组化和微卫星不稳定性检测(见表1)

表 1 免 疫 组 化和微卫星不稳定性检测结果

2.2 遇 志11NPCC:家系的敏感性润嗬异性(见表2)

表2 遴选11NPCC家系的敏感性和特异性(%)

3 讨论

HNPCC 是一种特殊类型的结直肠癌。错配修复基因的种系突变导致的常染色体显性遗传病，HNPCC家族中有50写的成员可能携带该基因的突变，携带该基因突变的患者发生结直肠癌的危险性在90%以上，其他器官肿瘤的发生也明显升高，因此对于HNPCC家族成员进行长期的医疗随访，可以发现早期大肠癌，提高大肠癌患者的生存率。近年来，对HNPCC家族成员应用化学药物如环氧化物酶一I预防，明显降低大肠癌的发生率。Jarvmen等C61通过肠镜随访，对1个HNPCC家系进行队列研究表明，使HNPCC家族的大肠癌的死亡率降低了65%。对于HNPCC患者来讲，结直肠癌发生早，同时及异时性多原发癌发生率高，我们报道t;的HNPCC患者多原发癌发生率为16.7%，第一个癌与第二个癌发生相距为66个月，而且约50%的HNPCC家系中可以发生肠外肿瘤，如子宫内膜癌、膀肤癌等，HNPCC患者同样为恶性肿瘤发生的高危人群。因此，从散发性结直肠癌中筛选出HNPCC的患者和家系，进行长期的医疗随访和干预，对提高结直肠癌治疗的5年生存率有重要的临床意义。

筛选HNPCC的根本方法是进行错配修复基因突变的检测，但是基因突变的检测费用昂贵、费时，很难在临床广泛应用，而且尽管目前基因检测的方法较多，但是其敏感性也仅为40%一70%,本小组报道的敏感性为50%。因此，国内外应用基因突变检查进行HNPCC的家系筛选尚处于小范围的实验阶段。HNPCC临床筛选金标准是1991年国际HNPCC合作组织(ICG一HNPCC)制定的Amsterdam标准，但是该标准过于严格，而且未将肠外肿瘤包括在内，具有局限性。1998年ICG一HNPCC制定Amsterdam标准(II)，将肠外肿瘤包括在诊断标准内，扩大了其范围。但是不管是何种临床标准，都不具有前瞻性，很难早期筛选出HNPCC家系。

HNPCC 患者肿瘤组织中，由于错配修复基因发生杂合性缺失，错配修复蛋白不表达，因此在肿瘤组织中检测错配修复蛋白表达，可以间接地了解错配修复基因的变异情况。Cawkwellt93等发现在MSI一H的结直肠癌中，利用免疫组化的方法检查，100%(66/66)患者表现为hMLHI和(或)hM SH2蛋白的表达缺乏。Marcus等研究在已知的携带hMLH1和hMSH2突变的16例HNPC〔患者结直肠癌组织中免疫组化检测均与基因检测相符，通过研究38例MSIH肿瘤后认为，免疫组化在预测hMLHI和hMSH2基因突变的敏感性97%(95%可信区间86%-100%)，特异性为100% (95%可信区间92%~100%)。本组研究表明，应用免疫组化检测筛选HNPCC患者的敏感性为91.7%、特异性为87. 5%。尽管这些研究对hMLH1和hMSH2基因免疫组化筛选HNPCC价值进行了充分的肯定，但是从理论上来讲通过免疫组化预测基因的变异有如下几个缺陷:① hMLH1和 hMSH2基因发生突变，但其表达产物的抗原决定簇并未破坏，尽管产物无功能但免疫组化检测仍为“正常”，因此可能出现假阴性。② 由于肿瘤标本中检测的〕iMLH 1和hMSH2基因

的体细胞突变，而错配修复基因的体细胞突变在散发性结直肠癌中也可能起一定作用，因而出现假阳性结果。③ 错配修复基因家族中其他成员也可能导致HNPO，可能出现假阴性结果。④ 石蜡包埋组织保存时间较长免疫组化检测结果不可靠。因此单独使用hNILHI和hMSH2免疫组化检测可能存在潜在的不可靠因素。

错配修复基因突变的表现型微卫星不稳定，目前是公认的发生结直肠肿瘤的一条途径。在符合Amsterdam标准的HNPCC患者中，95%患者具有MS]特征C123。在本组患者中，12例HNPCC患者MSI检测均为MS}一Ho1 997年，NCI(N ationalCancer Institution)将MSI确定为检测和筛选HNPCC的重要方法之一，而且推荐将BAT 26 ,BAT2 5,D 2S123,D 5S346和D17S250作为检测HNPCC的位点[1a7。但是MS]同样为一种体细胞的变异，并不全出现在错配修复基因突变的肿瘤中，其他的分子事件也可能发生MSI，因此单纯检测MSI的变异也存在可能。在本组中，应用MSI检测来筛选HNPC(:其敏感性为100%而特异性为75%。

尽管从表观的hINLH1和hMSH2免疫组化检测和MS 检测在检测HNPCC家系中，其敏感性和特异性是可以接受的，但是两者由于理论上的缺陷，进行大样本检测时假阳性和假阴性发生可能会上升，而两者结合敏感性为91.7% ，特异性为93.8%，均非常满意。通过错配修复基因突变后的表达产物和表型的改变来筛选HNPCC家系，增加了筛选的准确性，提高了敏感性，减低了筛选的误差。Rabelo等在综述文献的基础上认为，通过MSI和免疫组化检测是筛选HNPCC的简单而且经济的方法。随着其他MMR基因家族成员的单克隆抗体的问世，免疫组化可以扩大至如hMSH6,hPSM1,hP SM2等基因。通过上述方法筛选出HNPCC的家系，然后通过基因检测可以进一步确诊携带何种错配修复基因的突变，是哪一个外显子发生变异，然后在家族中进行该外显子突变的检测.不但可以发现携带突变的个体对其密切的医疗随访有重要意义，而且可以使未携带该基因突变的患者免受 长期医疗随访的干扰。Ramesar等对一个HNPCC家系的500名家属进行了10年的随访和观察，通过基因检测，认为有仅70%的人需要随访，减少了随访的费用，降低了大肠癌的发病率和死亡率。

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